Berruguete est le fils aîné de l'une des principales figures de la peinture hispanique du dernier quart du XVe siècle, Pedro Berruguete, dans l'atelier duquel il a dû commencer sa formation. Après la mort prématurée de son père en 1503, il part en Italie pour compléter sa formation, résidant à Florence et à Rome entre des dates contestées, la plus communément admise étant 1506 pour son départ et 1518 pour son retour. Il y trouve une certaine protection auprès de Michel-Ange, dont il rejoint le cercle florentin par l'intermédiaire de Francesco Granacci.
Il est certain qu'en 1518, il était déjà en Espagne pour exécuter le tombeau du plus haut dignitaire de la cour carolingienne nouvellement arrivée, celui du chancelier Selvaggio (Jean Sauvage) à Saragosse, ce qui montre qu'il jouissait déjà d'une certaine réputation. Par la suite, il a continué à servir parmi les artistes de la cour et est entré dans le cercle de l'architecte royal Alonso de Covarrubias. La commande, en 1526, du retable de San Benito el Real à Valladolid marque un tournant dans sa vie et son œuvre, car elle lui permet de se faire construire à Valladolid une résidence palatiale conforme à ses prétentions sociales et d'installer un grand atelier avec lequel il peut entreprendre d'importantes commandes. De l'Italie, il apporte non seulement des idées et une formation, mais aussi une approche moderne du travail de l'artiste qui, selon Manuel Arias, "se fonde sur le dessin, conformément aux postulats établis en Italie, où son art s'est forgé". Berruguete travaillait en maître, traçant dessins et croquis, réalisant des cartons que ses agents transféraient ensuite sur le support définitif".
Ses deux centres de production étaient Valladolid, où il avait sa résidence et son atelier, et Tolède, où il réalisa son œuvre de maturité grâce au patronage et même à la protection du cardinal Tavera qui, probablement dès 1523, alors qu'il était président de la chancellerie royale de Valladolid, lui avait assuré un poste de notaire. À Tolède, il réalisa sa plus grande œuvre, les stalles du chœur de sa cathédrale, et sa dernière œuvre, le tombeau de son grand bienfaiteur, et trouva même la protection du chanoine fabricant Diego López de Ayala qui, peut-être, en tant que l'un des responsables du programme iconographique de la chapelle du Sauveur à Úbeda, l'aida à être sollicité par la veuve de Francisco de los Cobos, María de Mendoza, pour la commande du retable de la Transfiguration.
Son style se caractérise par l'intensité émotionnelle et le mouvement dramatique de ses personnages, avec une certaine insouciance, parfois, pour la technique. Sa production est abondante en retables et stalles de chœur comme celui mentionné ci-dessus pour la cathédrale de Tolède (1539-1548), où il a sculpté sur du noyer, sans aucune polychromie, une merveilleuse galerie de figures de prophètes et de saints dans une grande variété de poses et animés d'une intense vie intérieure. D'autres chefs-d'œuvre, outre ceux mentionnés ci-dessus, sont les retables de la Mejorada de Olmedo (1526), celui de San Benito à Valladolid (1526-1532), dans lequel des scènes des bénédictins et de la vie du Christ sont représentées en relief, et celui de l'Adoration des rois (1537), également à Valladolid.
